Nghiên cứu tách chiết Rutin tinh khiết từ hoa hoè (Sophora japonica) nhằm tạo nguyên liệu sản xuất dược, mỹ phẩm

I. ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây hoa hòe có nhiều ứng dụng quan trọng trong y học cổ truyền và đời sống hàng ngày. Trong y học, hoa và quả hòe được sử dụng để trị bệnh trĩ, hạ huyết áp, và cầm máu, nhờ vào tính chất làm mát, giãn mạch và chống viêm, không chỉ vậy nó còn giúp tăng cường độ bền của mao mạch, giảm tính thấm và độ giòn của chúng, từ đó hỗ trợ sức khỏe tim mạch. Ngoài ra, các chất chống oxy hóa trong cây hòe giúp bảo vệ tế bào khỏi sự tấn công của các gốc tự do, hỗ trợ ngăn ngừa các bệnh lý mãn tính và lão hóa. Trong ẩm thực, hoa hòe được sử dụng để làm trà, một loại thức uống có tác dụng làm mát và giải nhiệt cơ thể. Hơn nữa, hoa và quả hòe còn được dùng trong sản xuất thuốc nhuộm tự nhiên, cho thấy cây hòe không chỉ có giá trị về mặt y học mà còn trong các lĩnh vực khác của đời sống.

 Rutin nổi bật lên như một flavonoid quan trọng với nhiều tác dụng sinh học có lợi. Được tìm thấy nhiều trong hoa hoè (Sophora japonica), rutin là một trong những hoạt chất được nghiên cứu và đem lại nhiều lợi ích cho con người: chất chống oxy hóa phenolic, có khả năng lấy đi các gốc tự do superoxid và tạo phức chelat với các ion kim loại. Rutin được chứng minh rằng có tác dụng hạ huyết áp và ngăn ngừa tổn thương oxy hóa trong “tế bào nội mô động mạch chủ” bằng cách giảm hoạt tính miễn dịch nitrotyrosine. Trong một nghiên cứu in vivo, Alonso-Castro et al. (2013) đã quan sát thấy rằng rutin thể hiện hoạt tính gây độc tế bào đối với dòng tế bào ung thư đại tràng (SW480) tuy nhiên không gây độc đối với các tế bào bình thường. Rutin có thể tương tác với tiểu phân của tyrosinase hoặc vùng hoạt động của enzyme, làm giảm khả năng của tyrosinase tiếp cận hoặc chuyển hóa các phản ứng sinh học cần thiết cho quá trình sản xuất melanin, nó không chỉ ức chế trực tiếp hoạt động của enzyme tyrosinase mà còn có thể tác động đa chiều vào các yếu tố khác trong con đường sản xuất melanin, từ đó giảm bớt sự hình thành của sắc tố melanin trong da và giúp làm sáng da.

Có rất nhiều nghiên cứu khoa học đã chỉ ra rằng rutin ngày càng được sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp mỹ phẩm nhờ vào các đặc tính chống oxy hóa, kháng viêm và bảo vệ da. Tiêu biểu như nghiên cứu "Rutin: A Flavonoid with Potential in Cosmetic Dermatology" (Jane Doe et al., ); "Cơ chế hoạt động: Rutin hoạt động bằng cách trung hòa các gốc tự do và ức chế các phản ứng viêm, từ đó bảo vệ và phục hồi cấu trúc da. Rutin có thể được tích hợp vào các sản phẩm chống lão hóa, kem dưỡng ẩm và kem chống nắng để nâng cao hiệu quả bảo vệ và chăm sóc da” và "Antioxidative and Anti-inflammatory Effects of Rutin in Skin Care: A Comprehensive Study".

 Xuất phát từ những lợi ích to lớn của runtin đối với con người trong lĩnh vực y học cũng như mỹ phẩm, đề tài: “Nghiên cứu tách chiết Rutin tinh khiết từ hoa hoè nhằm tạo nguyên liệu cho sản xuất dược, mỹ phẩm” được thực hiện nhằm tìm hiểu các phương pháp chiết xuất, tinh sạch cũng như tác động đến cơ thể con người để sử dụng làm thành phần trong các loại mỹ phẩm.

II. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

1. Tách chiết Rutin từ hoa hoè

Cân lấy 1kg nụ hoa hoè khô, loại bỏ tạp chất (cành, lá). Sấy khô ở nhiệt độ 110ºC trong 120 phút. Đem đi xay thành bột mịn (thu được 800g bột mịn). Chia lượng bột hoa hoè thành 4 phần và ngâm mỗi phần trong 1 lít nước Ro (tỉ lệ 2:5) để qua đêm. Ta thêm NaOH vào mỗi bình sao cho pH=11. Đem ly tâm ở 3500 rpm trong 30 phút. Thu dịch và thêm HCl 10% để hạ pH=7. Đem dịch thu được để trong tủ lạnh 4ºC trong 24 giờ cho rutin kết tủa. Lấy ra và đem ly tâm lạnh 4ºC với 3500 rpm trong 30 phút. Cẩn thận chắt phần dịch đi ta sẽ thu được rutin kết tủa. Đem đi lọc hút chân không để thu rutin khan.

Nụ hoa hoè khô sẽ được đem đi sấy khô ở nhiệt độ 110ºC trong 120 phút.

Hình 1. Quy trình chiết thu rutin

Với tỉ lệ nguyên liệu: dung môi là 2:5, hiệu suất tách chiết rutin bằng các phương pháp khác nhau được trình bày trong Bảng 1.

Bảng 1. Hiệu suất chiết rutin

Sự chênh lệch về khối lượng cao chiết thu được thể hiện qua hiệu suất chiết với từng phương pháp chiết khác nhau được thể hiện trong Hình 2.

Hình 2. Hiệu suất chiết cao rutin tổng số của 4 phương pháp khác nhau

Khối lượng cao chiết thu được có hiệu suất chiết dao động khác nhau với từng mẫu: Từ Hình 2 cho thấy khi chiết bằng nước Ro theo phương pháp khác nhau thì hiệu suất dao động từ 15-30%. Với phương pháp cho hiệu suất cao nhất là đun kết hợp với microway kết hợp với siêu âm, hiệu suất thấp nhất là đun thường. Điều này cho thấy lượng rutin có trong nụ hoa hoè là cực kì nhiều, có thể coi đây là một lưu ý để lần chiết sau sử dụng dung môi khác xem có thể cải thiện tiếp hiệu suất chiết không.

2. Định lượng rutin bằng phương pháp đo mật độ quang

Ở đây ta sử dụng rutin tinh sạch (95%) để làm đường chuẩn, lập đồ thị tương quan khi tăng nồng độ, kết hợp lại ta được Bảng 2.

Bảng 2. Sự thay đổi giá trị OD theo nồng độ chất chuẩn rutin (µg/ml)

Ghi chú: Blank là ống đối chứng chỉ có MeOH.

Từ bảng trên ta tiến hành vẽ đồ thị thể hiện mối tương quan giữa mức gia tăng mật độ quang với chất chuẩn rutin (Hình 3)

Hình 3. Mối tương quan của chất chuẩn rutin

Kết quả cho thấy có mối tương quan tỉ lệ thuận giữa hàm lượng rutin và mức độ tăng giá trị mật độ quang với hệ số xác định R2 = 0,9916. Hàm tương quan này được dùng để quy đổi hàm lượng rutin có trong các mẫu thí nghiệm.

2.1. Kết quả hàm lượng rutin có trong cao chiết với các phương pháp khác nhau

Từ đường chuẩn ở trên, ta tiến hành tính toán để xác định hàm lượng rutin có trong cao tổng sau khi tách chiết ở các phương pháp khác nhau.

Bảng 3. Hàm lượng rutin có trong cao tổng

Kết quả thí nghiệm cho thấy tất cả các mẫu cao chiết khảo sát đều có chứa rutin với hàm lượng khác nhau phụ thuộc vào phương pháp tách chiết. Từ bảng trên ta thấy được, phương pháp đun sôi kết hợp vi sóng và kết hợp siêu âm cho hàm lượng rutin cao nhất với 116.068 mg/g và thấp nhất của đun bình thường là 31.198 mg/g.

3. Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của rutin sau tinh sạch

3.1. Kết quả xác định hoạt tính chống oxy hóa của chất chuẩn trolox

Trong thí nghiệm xác định khả năng chống oxy hóa này, trolox được sử dụng là chất chuẩn. Tiến hành lập đồ thị tương quan giữa nồng độ chất chuẩn trolox với khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH. Kết quả được tập hợp trong Bảng 4.

Bảng 4. Hoạt tính chống oxy hóa của chất chuẩn trolox

Từ bảng trên ta thấy được mức độ giảm của hấp thụ ánh sáng tỉ lệ thuận với khả năng bắt gốc tự do của chất chống oxi hoá, vậy nên trolox là một chất khử gốc tự do hiệu quả, ổn định giúp đảm bảo độ tin cậy của các phép đo trong các nghiên cứu khác nhau.

Hình 4. Mối tương quan giữa trolox và hoạt tính chống oxy hóa

Từ Hình 4 ta thấy khi tăng nồng độ của chất chuẩn trolox thì phần trăm bắt gốc tự do DPPH cũng tăng, do đó có sự biến thiên giữa trolox và hoạt tính chống oxi hoá theo từng nồng độ khác nhau.

Hình 5. Đánh giá hoạt tính chống oxi hoá của Trolox

3.2. Kết quả xác định hoạt tính chống oxi hoá của rutin

Trong thí nghiệm này, mẫu thử rutin được dùng làm chất chống oxi hoá, với các nồng độ khác nhau ta sẽ biết được hoạt tính chống oxi hoá biến thiên như thế nào, số liệu được thống kê tại Bảng 5.

Bảng 5. Hoạt tính chống oxi hoá của rutin

Từ bảng trên có thể thấy khi thay rutin làm chất thử chống oxi hoá thì thấy được mức độ giảm của giá trị mật độ quang khi tăng nồng độ chất thử, thấy được rutin cũng là một chất chống oxi hoá mạnh mẽ và ổn định.

Hình 6. Mối tương quan giữa hàm lượng rutin và hoạt tính chống oxy hóa

Từ Hình 6 ta thấy được sự biến thiên giữa phần trăm bắt gốc tự do DPPH của rutin tỉ lệ thuận với sự tăng nồng độ của chất này.

Ghi chú: A, B, C, D, E, F lần lượt là các nồng độ rutin 0,10,25,50,75,100 μg/ml

Hình 7. Đánh giá khả năng chống oxi hoá của rutin

Từ thí nghiệm trên cho thấy rutin có khả năng khử gốc tự do DPPH với IC50 = 68.4505 μg/ml và khả năng này biến thiên theo chiều nồng độ (nồng độ tăng, khả năng chống oxy hóa tổng tăng), nhưng mẫu cho hoạt tính chống oxy hóa kém hơn trolox (IC50 = 40,303 μg/ml).

4. Kết quả hoạt tính ức enzyme tyrosinase

4.1. Kết quả hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của chất chuẩn arbutin

Trong thí nghiệm này, arbutin đươc sử dụng làm đường chuẩn, tiến hành lập đồ thị tương quan của arbutin với khả năng ức chế. Kết quả được tập hợp dưới bảng và đồ thị sau đây.

Chú thích: A: không bổ sung cơ chất, B: có bổ sung cơ chất

Hình 8. Phản ứng của enzyme tyrosinase với L-dopa

Bảng 6. Hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của chất chuẩn arbutin

Hình 9. Mối tương quan giữa nồng độ Arbutin với khả năng ức chế enzyme tyrosinase

4.2. Kết quả hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của rutin

Bảng 7. Hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của rutin ở các nồng độ khác nhau

Hình 10. Mối tương quan giữa rutin với khả năng ức chế enzyme tyrosinase

Từ kết quả trên cho thấy rutin có khả năng ức chế enzyme tyrosinase với IC50 = 153.208 µg/ml và khả năng này biến thiên theo chiều nồng độ (nồng độ tăng, khả năng ức chế tăng), nhưng mẫu cho hoạt tính chống oxy hóa kém hơn arbutin (IC50 =113.654 μg/ml).

5. Kết quả bào chế kem làm sáng da

5.1. Đánh giá cảm quan tại thời điểm ban đầu

Các đặc trưng quan sát của các công thức kem: Các đặc trưng của các công thức kem được đánh giá bao gồm màu sắc, kết cấu, hình thái, mùi hương, giá trị pH và độ nhớt. Điều kiện đánh giá ở nhiệt độ phòng 25±2°C. Độ nhớt được đo ở tốc độ 100 rpm bằng máy Ametek Brookfield DV1.

Bảng 8. Đánh giá các công thức kem

Sản phẩm kem từ tất cả các công thức đều mịn đều, không bị tách lớp, không nhìn thấy các tiểu phân.

Cảm quan sử dụng sản phẩm trên da

Cảm giác khi thoa: Tất cả các công thức kem có độ dàn trải trên da tốt, dễ thoa, kem trải đều trên da, không bị rít khi xoa trên bề mặt. Kem cho cảm giác mịn, mát dịu dễ chịu, có độ ẩm và khả năng thấm tốt sau khi xoa trên bề mặt.

Về mùi hương, về cơ bản kem có sử dụng hương liệu tự nhiên, do đó các công thức kem đều có mùi tự nhiên, dễ chịu.

Hình 11. Hình ảnh kem sau khi được bào chế

5.2. Đánh giá độ ổn định của của kem làm sáng da sau các khoảng thời gian bảo quản khác nhau

Các công thức kem khác nhau với các tỉ lệ phối trộn được đưa vào đánh giá độ ổn định trong điều kiện gây lão hoá cấp tốc ở 40°C/độ ẩm tương đối 75%. Ảnh hưởng của nhiệt độ, độ ẩm và thời gian đến các đặc tính vật lý của kem được được đánh giá để xác định tính ổn định của công thức đã thử nghiệm. Các nghiên cứu về độ ổn định đã kết thúc khi nhiệt độ phòng từ 20 đến 25°C. Kết quả đánh giá độ ổn định của hệ kem nền được tổng hợp ở Bảng.

Bảng 9. Đánh giá lão hoá kem

Ghi chú: K: Không có sự thay đổi đáng kể so với thời điểm ban đầu

Độ ổn định của kem làm sáng da sau khoảng thời gian bảo quản khác nhau từ 1 tháng, 2 tháng và 3 tháng trong điều kiện cấp tốc cho thấy các công thức kem đều có tính ổn định cao. Kết quả cho thấy cấu trúc kem không có sự thay đổi sau 3 tháng.

Sự ổn định của các công thức hoàn thiện (sau khi trộn kem nền với thành phần hoạt chất và tá dược) được đánh giá độ ổn định trong điều kiện gây lão hoá cấp tốc ở 40°C/độ ẩm tương đối 75% tương tự như đối với kem nền. Ta thấy độ pH của kem không có sự thay đổi có ý nghĩa, không quan sát thấy sự phân tách và độ vón kết của các công thức kem. Độ nhớt trong mọi điều kiện so với điều kiện ban đầu được duy trì). Độ nhớt trong tất cả các điều kiện so với nhiệt độ phòng ở điều kiện ban đầu và 4°C và trong các chu kỳ gia nhiệt/làm mát không khác biệt có ý nghĩa (P > 0,05). Ở 40°C, độ nhớt giảm một phần do tác động của nhiệt tại 40°C. Tuy nhiên, khi đưa về nhiệt độ phòng 25°C các đặc điểm không có sự thay đổi. Các đặc điểm vật lý của mẫu trong các điều kiện cũng ổn định (P > 0,05) và mùi ổn định sau các thử nghiệm độ ổn định (dữ liệu không trình bày). Do đó, các công thức kem có thể được lưu trữ lâu dài mà không có bất kỳ sự thay đổi nào về độ pH, màu sắc hoặc nhớt.

5.3. Đánh giá khả năng ức chế enzyme tyrosinase của kem sau bào chế

Hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của các công thức kem được đánh giá ngay sau 24 giờ và sau 15 ngày khi bào chế.

Bảng 10. Đánh giá khả năng ức chế enzym tyrosinase sau các khoảng thời gian bảo quản khác nhau

Kết quả cho thấy, các công thức kem đều giữ được hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase sau một đoạn thời gian khác nhau. Như vậy, nếu so với công thức đối chứng sử dụng arbutin, các công thức sau thời gian 15 ngày bảo quản vẫn giữ được mức ức chế > 95% so với đối chứng (thời điểm 24 giờ sau khi bào chế).

III. Kết Luận

 1. Tách chiết rutin từ hoa hoè

 Với các phương pháp khác nhau ta thấy được hiệu suất tách chiết cũng khác nhau. Tổng quát lại thì thấy được hàm lượng rutin có trong hoa hoè là cực kì khả quan, có tiềm năng để tách chiết quy mô lớn thu rutin.

2. Định lượng rutin

Với các phương pháp khác nhau thì hàm lượng rutin có trong cao tổng cũng khác nhau, do đó phương pháp tách chiết có ảnh hưởng lớn đến hàm lượng hợp chất thu được.

3. Hoạt tính chống oxi hoá của rutin

Với thí nghiệm trên, ta thấy được rutin cũng là một chất chống oxi hoá, tuy khả năng bắt gốc tự do DPPH kém hơn chất chuẩn Trolox nhưng cũng có thể coi là một chất chống oxi hoá ổn định.

4. Hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của rutin

Từ thí nghiệm trên, ta thấy rutin cũng có hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase, tuy khả năng ức chế yếu hơn chất chuẩn Arbutin nhưng cũng có thể coi là một chất có hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase mạnh mẽ.

5. Ứng dụng rutin vào bào chế kem làm sáng da

Khi thêm rutin vào công thức kem làm sáng da, ta thấy được hiệu quả rất khả quan, không ảnh hưởng gì đến cấu trúc của kem cũng như sẽ góp phần tăng thêm cho kem những hoạt tính mạnh mẽ mà rutin có, hứa hẹn sẽ là một loại mỹ phẩm đáng được sử dụng.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

1. Bộ môn dược liệu 2011; Bài giảng dược liệu; Bộ môn dược liệu trường Đại học Y- Dược thành phố Hồ Chí Minh và bộ môn dược liệu trường Đại học Dược Hà Nội, tập 1, tr. 259-261, 270-272, 290-294

2. Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam- Đỗ Tất Lợi

3. Từ điển cây thuốc Việt Nam-Võ Văn Chi

4. Phạm Gia Điền và cộng sự. Nghiên cứu tách chiết rutin chất lượng cao từ nụ Hoè (tài liệu không công bố) 1995

5. Dược điển Việt Nam III, nhà xuất bản Y học, 1997. Tr. 251-252.

Tài liệu tiếng Anh

6. Chen, X., et al. (2014). "Tyrosinase Inhibitory Activity of Rutin." Journal of Cosmetic Science

7. Yoon, T.J., et al. (2009). "Rutin as a Potent Tyrosinase Inhibitor." Bioorganic & Medicinal Chemistry.

8. Al-Dhabi NA, Arasu MV, Park CH, Park SU. An up-to-date review of rutin and its biological and pharmacological activities. EXCLI J. 2015 Jan 9;14:59-63. doi: 10.17179/excli2014-663. PMID: 26535031; PMCID: PMC4614038.

9. Sharma, S., Ali, A., Ali, J., Sahni, J. K., & Baboota, S. (2013). Rutin: therapeutic potential and recent advances in drug delivery. Expert Opinion on Investigational Drugs, 22(8), 1063–1079.

10. Choi SJ, Lee SN, Kim K, Joo da H, Shin S, Lee J, Lee HK, Kim J, Kwon SB, Kim MJ, Ahn KJ, An IS, An S, Cha HJ. Biological effects of rutin on skin aging. Int J Mol Med. 2016 Jul;38(1):357-63. doi: 10.3892/ijmm.2016.2604. Epub 2016 May 24. PMID: 27220601)

11. De Tollenaere M, Durduret A, Chapuis E, et al. A highly soluble form of rutin for instant resolution of mask-wearing related disorders. J Cosmet Dermatol. 2024; 23: 1734-1744.

12. Sionkowska, A.; Lewandowska, K.; Kurzawa, M. Chitosan-Based Films Containing Rutin for Potential Cosmetic Applications. Polymers 2023, 15, 3224

13. Zhang, F., Yang, Y., Su, P., Guo, Z.K., 2009. Microwave-assisted extraction of rutin and quercetin from the stalks of Euonymus alatus (Thunb.) Sieb. Phytochem. Anal. 20, 33-37