Trịnh Thị Thu Thủy1, Trương Quốc Phong2
1:Nhóm NCM Công nghệ Nano và Công nghệ Protein tái tổ hợp, Khoa CNSH, Học viện Nông nghiệp Việt Nam; 2: Viện CNSH và CNTP, Đại học Bách Khoa Hà Nội
Lactoferrin (LF) là một protein liên kết với sắt không chứa nhân hem (Embleton và cs. , 2013; Orla M. Conneely, 2017), một thành phần trong họ protein trasferrin với chức năng chung là vận chuyển sắt trong máu (Gonzalez-Chavez và cs. , 2009). LF là một thành phần protein chiếm hàm lượng cao thứ 2 trong sữa sau casein (Nakamura và cs. , 2001). Hàm lượng LF cũng có sự thay đổi lớn, với nồng độ cao nhất là 7 g/l sữa non của người, 1 g/l đối với sữa người trong giai đoạn tiết sữa và 0,4 mg/l trong huyết thanh của người bình thường và tăng lên 5000 lần khi có sự nhiễm khuẩn. LF có hàm lượng cao trong sữa của động vật có vú như bò, lợn, dê, lạc đà…(Chen và cs. , 2004; Chahardooli và cs. , 2016). LF có khả năng kháng khuẩn, kháng virus kháng ký sinh trùng, kháng viêm hoặc ức chế khối u… Là một protein đa chức năng, LF được coi là một protein tiềm năng có nhu cầu sử dụng cao trong công nghiệp dược phẩm, thực phẩm chức năng và mỹ phẩm.
Để chủ động nguồn cung cấp LF cho đến nay nhiều hệ biểu hiện LF tái tổ hợp đã được phát triển kể cả sinh vật nhân thực và nhân sơ. Các hệ thống biểu hiện LF tái tổ hợp bao gồm vi khuẩn, nấm men, nấm mốc, côn trùng, cell line, dê, thỏ, chuột, bò, thuốc là, lúa, khô, khoai tây, khoai lang, cà chua, linh lăng, sâm, lúa mạch. Các hệ thống biểu hiện này cho phép biểu hiện LF có nguồn gốc từ nhiều loài khác nhau như người, bò, ngựa, dê. Mức độ biểu hiện LF cũng khác nhau đối với mỗi vật chủ khác nhau (Bảng 1).
Bảng 1. Sinh tổng hợp LF tái tổ hợp (rLF) bởi các sinh vật khác nhau
|
Hệ biểu hiện
|
Nguồn gen
|
Mức độ biểu hiện
|
TLTK
|
|
Vi khuẩn
|
|
|
|
|
E. coli
|
bLf
|
15,3 mg/L
|
Garcı´a-Montoya et al., 2013
|
|
|
bLfc
|
10 mg/L
|
Tian et al., 2007
|
|
|
Lfc
|
60 mg/L
|
Kim et al., 2006
|
|
|
bLfc
|
2 mg/L
|
Feng et al., 2006
|
|
|
Kumin Lf
|
17 mg/L
|
Wang et al., 2010
|
|
Lactobacillus casei
|
hLf
|
10,6 mg/ml
|
Chen et al., 2010
|
|
Rhodococcus erythropolis
|
bLf thùy C
|
2,6 mg/ml
|
Kim et al., 2006
|
|
Nấm men
|
|
|
|
|
Pichia pastoris
|
bLf
|
3,5 g/L
|
Iglesias-Figueroa et al., 2016
|
|
|
hLf
|
115 mg/L
|
Ying et al., 2004
|
|
|
pLf
|
847 mg/L
|
Chen et al., 2004
|
|
|
cLf
|
2 mg/L
|
Chen et al., 2007
|
|
|
pLf
|
12 mg/L
|
Wang et al., 2002
|
|
|
Yak Lf
|
40 mg/L
|
Dong et al., 2006
|
|
|
eLf
|
40 mg/L
|
Paramasivam et al., 2002
|
|
|
hLf
|
1,2 g/L
|
Jiang et al., 2008
|
|
|
hLf
|
|
Choi et al., 2008
|
|
Pichia methonolica
|
pLf
|
|
Shan et al., 2008
|
|
|
bLfc
|
90 mg/L
|
Wang et al., 2007
|
|
Nấm mốc
|
|
|
|
|
Aspergillus awamori
|
hLf
|
2 g/L
|
Ward et al., 1995
|
|
A. oryzae
|
hLf
|
25 mg/L
|
Wad et al., 1992
|
|
Côn trùng
|
|
|
|
|
Spodoptera frugiperda
|
hLf
|
9,5 mg/L
|
Zhang et al., 1998
|
|
Bombyx mori
|
hLf
|
65 mg/L
|
Liu at al., 2005
|
|
|
hLf
|
13,5 µg/ 1,5 x 105 tế bào
|
Liu et al., 2006
|
|
|
pLf
|
205 µg/pupa
|
Wang et al., 2005
|
|
Cell lines
|
|
|
|
|
BHK
|
hLf
|
20 mg/L
|
Stowell et al., 1991
|
|
|
hLf
|
16 mg/L
|
Tutykhina et al., 2009
|
|
Động vật có vú
|
|
|
|
|
Dê
|
hLf
|
0,756 mg/L
|
Zhang et al., 2008
|
|
|
hLf
|
2 g/L
|
Han et al., 2007
|
|
Chuột
|
hLf
|
2,5 mg/ml
|
Nuijens et al., 1997
|
|
|
hLf
|
2,5 mg/ml sữa
|
Kim at el., 1997
|
|
Thỏ
|
hLf
|
2,3 mg/ml sữa
|
Han et al., 2008
|
|
Bò
|
hLf
|
1 g/L sữa
|
Van Berkel et al., 2002
|
|
|
hLf
|
2,9 mg/ml
|
Hyy et al., 2006
|
|
Thực vật
|
|
|
|
|
Nicotiana benthamiana
|
hLf thùy N
|
0,6% protein tan
|
Li et al., 2004
|
|
Nicotiana tabacum
|
hLf
|
0,1-0,8% protein tan
|
Zhang et al., 1998
|
|
|
hLf
|
4,3% protein tan
|
Choi et al., 2003
|
|
|
bLf
|
|
Nguyen et al., 2011
|
|
Lúa
|
hLf
|
1,6 mg/g hạt
|
Rachmawati et al., 2004
|
|
|
hLf
|
0,5% sinh khối tổng
|
Nandi et al., 2005
|
|
|
hLf
|
2-4% protein tan
|
Suzuki et al., 2003
|
|
|
hLf
|
0,1% protein tan
|
Chong et al., 2000
|
|
Khoai tây
|
hLf
|
0,1% protein tan
|
Conesa et al., 2010
|
|
Khoai lang
|
hLf
|
3,2µg/mg protein tan
|
Min et al., 2006
|
|
Panax ginseng
|
hLf
|
3% protein tan
|
Kwon et al., 2003
|
|
Cà chua
|
hLf
|
|
Lee et al., 2002
|
|
Ngô
|
hLf
|
|
Samyn-Petit et al., 2001
|
|
Linh lăng
|
hLf
|
|
Vlahova et al., 2005
|
|
Lúa mạch
|
hLf
|
|
Tanasienko et al., 2005
|
Hệ biểu hiện nấm mốc
Lactoferrin người tái tổ hợp đã được sản xuất trong A. niger var. awamori bởi công ty Agennix Inc., trong bò chuyển gen bởi công ty Pharming Technologies B.V., và trong lúa gạo bởi công ty Ventria Bioscience. Lactoferrin người tái tổ hợp đã được sản xuất với năng suất đạt 2 g/L môi trường lên men A. awamori (Nakamura và cs. , 2001); 5 g/L đối với A. niger var. awamori (Headson, 2000) và được tinh sạch bằng sắc ký trao đổi cation. Lactoferrin người tái tổ hợp được sản xuất bởi A. niger có đặc tính tương tự như hLF tự nhiên.
Hệ biểu hiện động vật
Bò chuyển gen mang gen mã hóa hLF người dưới sự điều khiển bởi promoter αs1-casein có khẳ năng tổng hợp 0,4-3,0 g/L sữa. LF tái tổ hợp trong sữa bò chuyển gen đã được tinh sạch bằng sắc ký trao đổi ion Mono S. Tương tự như LF sản xuất bởi nấm mốc, mặc dù LF tái tổ hợp từ bò có sự khác biệt về sự đường hóa so với LF tự nhiên nhưng hoạt tính của LF tái tổ hợp vẫn tương tự như dạng tự nhiên. Dê cũng là một vật chủ được sử dụng để sản xuất LF người tái tổ hợp. Hiệu suất tổng hợp LF tái tổ hợp trong sữa đạt 0,765 – 2,0 g/L, và rhLF được tinh sạch bằng sắc ký trao đổi ion với độ sạch đạt 97% (Han và cs. , 2007; Zhang và cs. , 2008). Một nghiên cứu gần đây của Yu và cộng sự 2012 đã tạo ra dê chuyển gen có khả năng tổng hợp LF người đạt khoảng 30 mg/ml sữa. Hiệu suất tinh sạch LF từ sữa toàn phần đạt khoảng 70% với độ sạch trên 98% (Wang và cs. , 2017).
Hệ biểu hiện thực vật
Đối với hệ biểu hiện thực vật, lactoferrin người tái tổ hợp cũng đã được biểu hiện trong lúa gạo và 0,5% trọng lượng hạt (Nandi và cs. , 2005).
Hệ biểu hiện vi khuẩn
Đối với hệ biểu hiện vi khuẩn trong đó chủ yếu là E. coli, hiệu suất biểu hiện LF tái tổ hợp là 2 – 60 mg/L. Mức độ tổng hợp LF này chỉ tương đương như LF trong sữa bò. Đối với hệ biểu hiện vi khuẩn nói chung và E. coli nói riêng không có sự biến đổi sau dịch mã đặc biệt là sự đường hóa protein trong khi đó LF là một glycoprotein nên hệ biểu hiện E. coli có những hạn chế trong việc sản xuất lactoferrin.
Hệ biểu hiện nấm men
Đối với hệ biểu hiện nấm men, là một sinh vật có hệ thống điều khiển gen đơn giản như vi khuẩn nhưng protein sau khi được tổng hợp có thể được biến đổi đặc biệt là có khả năng đường hóa protein nên rất phù hợp đối với glycoprotein LF. Cho đến nay nhiều nghiên cứu biểu hiện LF đã được thực hiện trong nấm men với hiệu suất đạt 2 – 3500 mg/L.
P. pastoris là một trong số ít nấm men có khả năng sử dụng methanol như nguồn carbon duy nhất. Ứng dụng của P. pastoris trong biểu hiện xuất phát từ việc khai thác promoter AOX, một promoter liên quan tới quá trình đồng hóa methanol. Con đường trao đổi methanol bắt đầu từ sự oxi hoá methanol thành formaldehyde, xúc tác bởi enzyme alcohol oxidase (AOX). Formaldehyde tạo ra sẽ tham gia vào các phản ứng oxi hoá, cung cấp năng lượng cho tế bào. Phần còn lại của formaldehyde được đồng hoá tạo nên các thành phần của tế bào nhờ một chu trình, bắt đầu từ phản ứng ngưng tụ giữa formaldehyde với xylulose 5-monophatphate xúc tác bởi dihydroxyaxetone synthetase. Nấm men P. pastoris kết hợp được những ưu điểm về khả năng sinh trưởng và mức độ biểu hiện của sinh vật nhân sơ đồng thời có khả năng thực hiện những biến đổi sau dịch mã protein. Nhiều protein tái tổ hợp đã được biểu hiện trong P. pastoris đạt gram/L.
Hệ thống biểu hiện P. pastoris đã được sử dụng để biểu hiện lactoferrin. Iglesias-Figueroa và cộng sự (2016) đã thực hiện biểu gen mã hóa LF bò trong P. pastoris KM71-H sử dụng hệ vector pJ902 dưới sự điều khiển promoter AOX1. Sau khi lên men mẻ và tinh sạch bởi sắc ký lọc gel, hiệu suất tổng hợp LF tái tổ hợp (rbLF) đạt 3,5 g/L. Protein rbLF dạng nguyên vẹn và dạng thủy phân bởi pepsin đều có hoạt tính kháng khuẩn đối với E. coli BL21(DE3), Staphylococcus aureus FRI137, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27833.
Elamdariz và cộng sự (2016) (Alamdari và cs. , 2016) cũng đã nghiên cứu biểu hiện lactoferrin lạc đà trong chủng nấm men cải biến PichiaPink (chủng nấm men được knock out gen mã hóa protease) sử dụng cấu trúc biểu hiện cảm ứng. Kết quả nghiên cứu cho thấy dòng nấm men tái tổ hợp sau khi được nuôi cấy và cảm ứng 24, 48, 96 và 144 giờ đều có hoạt tính kháng khuẩn mạng. Mức độ tổng hợp protein LF là cao nhất sau 48 giờ cảm ứng.
Chen và cộng sự (Chen và cs. , 2004) cũng đã thực hiện nghiên cứu tổng hợp lactoferrin lợn trong nấm men P. pastoris. Gen mã hóa LF của lợn được thiết kế trong vector biểu hiện sử dụng promoter cảm ứng AOX1 và trình tự tiết α-factor. Sau khi được cảm ứng LF tái tổ hợp được tổng hợp và tiết ra môi trường nuôi cấy khoảng 87 mg/L và một lượng lớn LF (760 mg/L) còn nằm lại trong tế bào. Protein LF tái tổ hợp cũng đã được tinh sạch sử dụng cột sắc ký ái lực heparin. Kết quả phân tích sự đường hóa protein LF tái tổ hợp cho thấy sự biến đổi sau dịch mã này đã tạo protein trưởng thành hoàn toàn tương tự protein LF tự nhiên trong sữa.
Trịnh Thị Thu Thủy và cộng sự (Thuy và cs. , 2018) đã xây dựng thành công cấu trúc tái tổ hợp mang gen mã hóa LF tối ưu hóa mã di truyền có nguồn gốc từ bò và biểu hiện thành công ở P. pastoris KM71H. LF tái tổ hợp đã được nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện biểu hiện trong môi trường khoáng thay thế môi trường tổng hợp BMMY và tiếp tục được nghiên cứu đặc tính.
Tài liệu tham khảo
Alamdari E., Niazi, A., Yarizade, A., Moghadam, A. và Aram, F. (2016). Expression of a Recombinant Therapeutic Protein, Lactoferrin, in PichiaPinkTM: a Powerful Antimicrobial Protein Biological Forum – An International Journal, 8(1): 471-478.
Chahardooli M., Niazi, A., Aram, F. và Sohrabi, S. M. (2016). Expression of recombinant Arabian camel lactoferricin-related peptide in Pichia pastoris and its antimicrobial identification, J Sci Food Agric, 96(2): 569-75.
Chen H. L., Lai, Y. W., Yen, C. C., Lin, Y. Y., Lu, C. Y., Yang, S. H., Tsai, T. C., Lin, Y. J., Lin, C. W. và Chen, C. M. (2004). Production of recombinant porcine lactoferrin exhibiting antibacterial activity in methylotrophic yeast, Pichia pastoris, J Mol Microbiol Biotechnol, 8(3): 141-9.
Embleton N. D., Berrington, J. E., Mcguire, W., Stewart, C. J. và Cummings, S. P. (2013). Lactoferrin: Antimicrobial activity and therapeutic potential, Semin Fetal Neonatal Med.
Gonzalez-Chavez S. A., Arevalo-Gallegos, S. và Rascon-Cruz, Q. (2009). Lactoferrin: structure, function and applications, Int J Antimicrob Agents, 33(4): 301 e1-8.
Han Z. S., Li, Q. W., Zhang, Z. Y., Xiao, B., Gao, D. W., Wu, S. Y., Li, J., Zhao, H. W., Jiang, Z. L. và Hu, J. H. (2007). High-level expression of human lactoferrin in the milk of goats by using replication-defective adenoviral vectors, Protein Expr Purif, 53(1): 225-31.
Nakamura I., Watanabe, A., Tsunemitsu, H., Lee, N. Y., Kumura, H., Shimazaki, K. I. và Yagi, Y. (2001). Production of recombinant bovine lactoferrin N-lobe in insect cells and its antimicrobial activity, Protein Expr Purif, 21(3): 424-31.
Nandi S., Yalda, D., Lu, S., Nikolov, Z., Misaki, R., Fujiyama, K. và Huang, N. (2005). Process development and economic evaluation of recombinant human lactoferrin expressed in rice grain, Transgenic Research, 14(3): 237-249.
Orla M. Conneely P. (2017). Anti-inflammatory Activities of Lactoferrin, PhD thesis.
Thuy T. T. T., Tinh, N. T. và Phong, T. Q. (2018). Nghiên cứu tạo cấu trúc biểu hiện tái tổ hợp pPICZαA::blfopt để biểu hiện lactoferrin bò trong Pichia pastoris Kỷ yếu hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc 2018: 306-313.
Wang M., Sun, Z., Yu, T., Ding, F., Li, L., Wang, X., Fu, M., Wang, H., Huang, J., Li, N. và Dai, Y. (2017). Large-scale production of recombinant human lactoferrin from high-expression, marker-free transgenic cloned cows, Scientific Reports, 7(1): 10733.
Zhang J., Li, L., Cai, Y., Xu, X., Chen, J., Wu, Y., Yu, H., Yu, G., Liu, S., Zhang, A., Chen, J. và Cheng, G. (2008). Expression of active recombinant human lactoferrin in the milk of transgenic goats, Protein Expr Purif, 57(2): 127-35.