Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải lignin phục vụ xử lý phụ phẩm sau thu hoạch nhãn

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nhãn là một trong những cây trồng phổ biến và có hiệu quả kinh tế cao. Hiện nay, diện tích trồng nhãn của Việt Nam ước tính khoảng 65.000 ha, sản lượng ước tính đạt 530 nghìn tấn (PTNT, 2019).  Cùng với đó là một lượng phụ phẩm sau thu hoạch là rất lớn và chưa được xử lý một cách hiệu quả, phần lớn được xử lý theo phương pháp truyền thống là đốt bỏ hoặc thải trực tiếp ra môi trường. Điều này không chỉ gây ô nhiễm mà còn chưa được tận dụng triệt để nguồn phụ phẩm sẵn có. Trong phụ phẩm có lượng lớn các chất hữu cơ như lignin, cellulose, hemicellulose…, trong đó lignin chiếm một lượng không nhỏ và khó phân giải. Hiện nay, có nhiều nghiên cứu được thực hiện để xử lý phụ phẩm, tuy nhiên chưa được hiệu quả và chưa được tập trung vào nguồn phụ phẩm nhãn. Đề tài “Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải lignin phục vụ xử lý phụ phẩm sau thu hoạch nhãn” nhằm mục đích tuyển chọn được các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải lignin trong bước đầu xử lý phụ phẩm và phục vụ cho các nghiên cứu sau này.

Vật liệu nghiên cứu bao gồm các chủng vi khuẩn được phân lập từ các mẫu đất, lá được thu tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam và Tỉnh Hưng Yên. Các vi khuẩn được phân lập và sàng lọc thông qua các phương pháp định tính trên môi trường acid tannic và định lượng với cơ chất đặc hiệu ABTS. Sau đó, các chủng vi khuẩn được tuyển chọn được  định tên thông qua đặc điểm hình thái và trình tự vùng 16S rDNA. Tiếp theo chúng tôi thực hiện các thí nghiệm ủ phụ phẩm với các chủng vi khuẩn đã được tuyển chọn nhằm bước đầu đánh giá khả năng phân huỷ lignin trong phế phụ phẩm nhãn.

KẾT QUẢ

· Phân lập, sàng lọc và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải lignin

Từ 5 mẫu đất và lá đã phân lập được 38 chủng vi khuẩn. Sau đó các chủng được sàng lọc hoạt tính  ligninolytic bằng phương pháp cấy chấm điểm trên môi trường LB bổ sung 0,2% acid tannic và thu được 5 chủng có khả năng sinh enzyme ligninolytic. (Hình 1)

Hình 1. Hình ảnh vòng phân giải LiP của các chủng vi khuẩn

Hình 1 cho thấy đĩa môi trường của 5 chủng D3.1, D3.2, D3.6, Đ401, Đ404 và Đ504 có xuất hiện màu nâu sẫm xung quanh khuẩn lạc chứng tỏ các chủng này sản sinh enzyme ligninolytic. Sau đó, sử dụng enzyme của các chủng vi khuẩn được tuyển chọn ở trên sẽ thử nghiệm với cơ chất đặc hiệu ABTS và đo ở bước sóng 405 nm theo mô tả của Sigma để xác định hoạt độ lignin peroxidase (LiP). Hoạt độ enzyme LiP được mô tả ở bảng 1.

Bảng 1. Hoạt độ LiP của các chủng vi khuẩn

Khi so sánh đến khả năng phân giải LiP, kết quả chỉ ra 2 chủng Đ404 và Đ504 có hoạt độ tương đối cao là 19 U/L và 18U/L, trong khi đó các chủng khác có hoạt độ thấp hơn là 13 U/L – 15 U/L.

Từ những kết qua thu được, chúng tôi chọn được 2 chủng có khả năng sinh ligninolyic lớn nhất là Đ404 và Đ504  tiếp tục nghiên cứu về khả năng phân giải cellulose và lignin trong các phụ phẩm nhãn.

·  Kết quả định danh các chủng vi khuẩn

Để định danh chính xác các chủng vi khuẩn Đ404 và Đ504 , chúng tôi đã giải trình tự đoạn gen 16S rDNA và so sánh trên CSDL NCBI. Đồng thời so sánh đặc điểm khuẩn lạc và đặc điểm hình thái đã quan sát được dưới kính hiển vi. Kết quả được hiện thị bảng 2.

Bảng 2: Kết quả định danh 2 chủng vi khuẩn Đ404 và Đ504

Tên chủng	Đặc điểm hình thái	Hình ảnh khuẩn lạc	%ident	BLAST
Đ404			99,32%	Bacillus Subtilis
Đ504			86,93%	Bacillus sp. RE1 (2011)

· Kết quả đánh giá khả năng phân huỷ lignin trong phế phụ phẩm nhãn

Thử nghiệm khả năng phân hủy các phế phẩm giàu lignin của 2 chủng vi khuẩn, chúng tôi tiến hành thí nghiệm ủ 2 chủng Đ404 và Đ504 với phế phẩm nhãn ở điều kiện phòng thí nghiệm trong 7 ngày. Sau khi kết thúc thí nghiệm, chúng tôi đánh giá sai khác về hàm lượng lignin trong các công thức ủ có bổ sung chủng vi khuẩn so với đối chứng (Bảng 3)

Bảng 3.  Hàm lượng Lignin trong phụ phẩm

Phân tích hàm lượng lignin của phụ phẩm nhãn trước và sau khi xử lý 2 chủng vi khuẩn so với đối chứng ta nhận thấy: khả năng phân giải lignin là tương đối tốt, dao động từ 0,99% đến 4,9%. Trong đó, hiệu quả xử lý trên các mẫu phụ phẩm của 2 chủng vi khuẩn là khác nhau. Khả năng xử lý của chủng Đ504 tốt nhất trên phế phụ phẩm vỏ nhãn với 4,83%; chủng Đ404 là cành nhãn với 4,9%. Trên cơ sở kết quả nghiên cứu này, chủng vi khuẩn Đ504, Đ404 có thể dùng để nghiên cứu trong quy mô lớn hơn, ứng dụng để làm giống sản xuất chế phẩm VSV xử lý phụ phẩm sau thu hoạch nhãn.

KẾT LUẬN

Nghiên cứu này nhằm mục đích phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy lignin góp phần tạo các loại chế phẩm phục vụ xử lý phụ phẩm nhãn. Với mục đích đó, chúng tôi đã thu thập các mẫu đất, lá nhãn mục ở các khu vực trồng nhãn khác nhau và tiến hành phân lập và thu đươc 38 chủng vi khuẩn. Sau đó, chúng tôi đã tuyển chọn được 2 chủng vi khuẩn là Đ404 và Đ504 có khả năng phân giải lignin với hoạt độ enzyme là Đ404: 19 U/L, chủng Đ504 là 18 U/L. Sau đó 2 chủng này được thực hiện khảo sát khả năng phân giải lignin với các phụ phẩm nhãn kết quả cho thấy khả năng phân giải lignin rất tốt. Trong đó, hiệu quả xử lý trên các mẫu phụ phẩm của 2 chủng vi khuẩn là khác nhau. Khả năng xử lý của chủng Đ504 tốt nhất trên phế phụ phẩm vỏ nhãn với 4,83%; chủng Đ404 là cành nhãn với 4,9%.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Miller, G. L. (1959). Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Analytical chemistry, 31(3), 426-428.

2. Coughlan, M. P., & Folan, M. A. (1979). Cellulose and cellulases: Food for thought, food for the future? International Journal of Biochemistry, 10(2), 103-108.

3. Palonen, H. (2004). Role of lignin in the enzymatic hydrolysis of lignocellulose: VTT Technical Research Centre of Finland.

Trịnh Thị Thu Thủy, Phan Thị Hiền – Khoa Công nghệ sinh học