Theo: Thi Nguyen, N., Hirata, M., Tanihara, F., Hirano, T., Le, Q. A., Nii, M., & Otoi, T. (2019). Hypothermic storage of porcine zygotes in serum supplemented with chlorogenic acid. Reproduction in Domestic Animals, 54(5), 750-755. https://doi.org/10.1111/rda.13417 

Vui lòng ghi rõ nguồn https://cnsh.vnua.edu.vn/  khi đăng lại nội dung này

Gần đây, phôi trước khi được cấy ở giai đoạn hợp tử thường được sử dụng để tạo ra lợn chuyển gen bằng cách sử dụng hệ thống chỉnh sửa bộ gen. Các kỹ thuật bảo quản lợn lâu dài như bảo quản lạnh và làm đông trong nitơ lỏng (LN2) cho kết quả khả thi (Dobrinsky, 2002). Tuy nhiên, nghiên cứu liên quan đến việc bảo quản ngắn hạn phôi lợn còn hạn chế. Do đó, phát triển một môi trường bảo quản lạnh có thể duy trì khả năng sống sót sau khi bảo quản của các hợp tử được tạo ra trong ống nghiệm trở nên cấp thiết để việc thao tác được thuận tiện.

Nghiên cứu của N.T. Nhiên và cộng sự điều tra ảnh hưởng của huyết thanh thai bò 100% (FBS) và dịch nang lợn 100% (pFF) như một môi trường bảo quản đối với khả năng phát triển của hợp tử lợn được bảo quản ở 25°C trong 24 giờ. Hơn nữa, nhóm tác giả đã đánh giá tác dụng phụ của Axit Chlorogenic (CGA) trong môi trường bảo quản. 

Các thí nghiệm cụ thể trong nghiên cứu được trình bày bên dưới.

Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của môi trường bảo quản đến sự phát triển của hợp tử.

Như thể hiện trong Bảng 1, khi các hợp tử của lợn được bảo quản trong 24 giờ, tỷ lệ hình thành phôi bào ở nhóm FBS cao hơn đáng kể (P<0.05) so với nhóm môi trường nuôi cấy mô 199 (TCM). Tuy nhiên, tỷ lệ hình thành phôi bào ở các nhóm được bảo quản thấp hơn đáng kể so với nhóm đối chứng không được xử lý bảo quản (P<0.01), không phụ thuộc vào môi trường bảo quản. Tỷ lệ phân cắt và tổng số tế bào trung bình trong phôi bào không khác nhau giữa các nhóm.

Bảng 1. Ảnh hưởng của môi trường bảo quản đến sự phát triển của hợp tử được bảo quản ở 25°C trong 24 giờ*

Ghi chú: Các giá trị với các ký tự trên khác nhau trong cùng một cột là khác nhau đáng kể (P:<:0,05). *Sáu thử nghiệm lặp lại đã được thực hiện. Dữ liệu được biểu thị bằng giá trị trung bình ± SEM **Đối chứng, các hợp tử được nuôi cấy trong 7 ngày mà không cần xử lý bảo quản.

Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của việc bổ sung Axit Chlorogenic (CGA) trong môi trường bảo quản đến sự phát triển của hợp tử.

Như thể hiện trong Bảng 2, khi hợp tử lợn được bảo quản trong 100% FBS có bổ sung hoặc không có các nồng độ CGA khác nhau trong 24 giờ, tỷ lệ hình thành phôi bào từ các hợp tử được bảo quản với CGA 50 µM cao hơn đáng kể (P<0.01) so với hợp tử được bảo quản với các nồng độ CGA khác. Tuy nhiên, tỷ lệ phân cắt và tổng số tế bào trung bình trong phôi nang không khác nhau giữa các nhóm.

Bảng 2. Ảnh hưởng của việc bổ sung CGA trong môi trường bảo quản đến sự phát triển của hợp tử được bảo quản ở 25°C trong 24 giờ*.

Ghi chú: Đối chứng, các hợp tử được bảo quản trong FBS không chứa dimethyl sulfoxide (DMSO) và CGA trong 24 giờ và sau đó được nuôi cấy trong 7 ngày. Các giá trị với các ký tự trên khác nhau trong cùng một cột là khác nhau đáng kể (P<0.01). * Bảy thử nghiệm lặp lại đã được thực hiện. Dữ liệu được biểu thị bằng giá trị trung bình ±SEM.

Thí nghiệm 3: Sự vận động hình thành phôi bào của hợp tử có được xử lý bảo quản hoặc không được xử lý bảo quản ở 25°C trong 24 giờ. 

Khi kiểm tra ngày hình thành và chất lượng của phôi bào có nguồn gốc từ hợp tử có hoặc không có xử lý bảo quản, tỷ lệ hình thành phôi bào cao nhất được quan sát vào ngày thứ 5 (ngày 0 = thụ tinh) ở nhóm đối chứng tươi (Số lượng phôi nang toàn bộ = 116, 83,6% ± 4,6%), trong khi tỷ lệ cao nhất ở nhóm được  bảo quản (Số lượng phôi nang nguyên vẹn = 59, 71,2% ± 2,3%) xuất hiện muộn hơn 1 ngày (Ngày 6; Hình 1). 

Khi kiểm tra nhân tự chết theo chương trình (apoptosis) trong tất cả các phôi nang, tỷ lệ nhân apoptotic trong phôi bào cao hơn đáng kể (P<0.05) ở nhóm được bảo quản (11,2% ± 1,0%) so với nhóm đối chứng (8,3% ± 0,6%).

Hình 1. Sự vận động hình thành phôi bào của hợp tử có được xử lý bảo quản (cột đen) hoặc không được xử lý bảo quản (cột trắng) ở 25 ° C trong 24 giờ. Hợp tử (N=679) được bảo quản trong huyết thanh thai bò có bổ sung 50 μM axit chlorogenic và sau đó được nuôi cấy trong 7 ngày. Khi kiểm soát, các hợp tử (N=499) được nuôi cấy trong 7 ngày mà không cần xử lý bảo quản. Sáu thử nghiệm lặp lại đã được thực hiện. Mỗi thanh đại diện cho tỷ lệ (trung bình ± SEM) trong toàn bộ quá trình hình thành phôi bào.

Kết luận và thảo luận

Dựa trên nghiên cứu này, nhóm tác giả phát hiện ra rằng khi các hợp tử lợn được bảo quản ở 25°C trong 24 giờ, nhiều hợp tử được bảo quản trong 100% FBS phát triển đến giai đoạn phôi nang hơn so với TCM chứa BSA. Huyết thanh chứa nhiều loại chất bao gồm các axit amin đóng vai trò quan trọng như chất thẩm thấu và chất đệm pH do đó có hiệu quả trong việc bảo quản phôi lợn trong thời gian ngắn. Tuy nhiên, huyết thanh gây ra thay đổi trong cấu trúc ty thể của phôi, nồng độ trong huyết thanh làm thay đổi độ nhớt của môi trường, có thể làm giảm khả năng phát triển của phôi được bảo quản. Vì vậy cần có thêm thử nghiệm để xác định nồng độ FBS có ảnh hưởng có lợi đến sự phát triển của phôi lợn sau khi bảo quản ngắn ở 25 ° C.

Việc bảo quản ngắn hạn của phôi lợn ở giai đoạn phôi dâu và phôi nang ở 25°C trong 24 giờ không có tác động bất lợi nào đối với khả năng sống và chất lượng của phôi. Ngược lại, việc bảo quản như vậy làm giảm sự phát triển của phôi ở giai đoạn phôi dâu (Nguyen và cộng sự, 2018). Trong nghiên cứu hiện tại, tỷ lệ hình thành phôi bào của hợp tử được bảo quản ở 25°C trong 24 giờ giảm so với ở hợp tử tươi, bất kể môi trường bảo quản. Khác biệt trong sự phát triển của phôi lợn sau khi bảo quản ngắn hạn có thể là do sự khác biệt về thành phần lipid, liên quan đến sự nhạy cảm với điều kiện lạnh.

Nhóm tác giả nhận thấy việc bổ sung môi trường bảo quản với 50 µM CGA đã cải thiện đáng kể tốc độ hình thành phôi bào của hợp tử sau khi bảo quản ở 25°C trong 24 giờ. Bằng chứng đáng kể từ các nghiên cứu trên động vật chỉ ra việc bổ sung chất chống oxy hóa, vitamin C và E, axit amin hoặc chất loại oxy phản ứng (ROS) có thể là các biện pháp thay thế giúp giảm stress oxy hóa, có lợi cho tỷ lệ sống sót của phôi và tỷ lệ hình thành phôi nang (Taylor, 2001). 

Kết quả đã chứng minh rằng tỷ lệ hình thành phôi bào cao nhất xuất hiện sau đó 1 ngày. Tuy nhiên, sự phát triển đến giai đoạn hơn 8 tế bào của hợp tử dự trữ ở 48 giờ sau khi bắt đầu bảo quản thấp hơn đáng kể so với hợp tử tươi. Do đó việc bảo quản ở nhiệt độ lạnh có thể gây ra sự ngừng phát triển tạm thời ở các hợp tử của lợn. Mặt khác, chất lượng phôi từ hợp tử được bảo quản trong 24 giờ giảm so với phôi từ hợp tử tươi, ngay cả khi hợp tử được bảo quản với nồng độ CGA thích hợp. 

Nghiên cứu kết luận 100% FBS tốt hơn TCM chứa BSA như một môi trường bảo quản để bảo quản hợp tử lợn ở 25°C trong 24 giờ. Hơn nữa việc bổ sung 50 µM CGA vào FBS có kết quả thuận lợi trong việc phát triển hợp tử sau bảo quản, nhưng chất lượng phôi phát triển từ hợp tử được bảo quản giảm. Từ những kết quả này, có thể cần xác định các điều kiện tối ưu để duy trì khả năng phát triển và chất lượng của hợp tử.

Người dịch: Nguyễn Hương Giang – K64CNSHE, Nguyễn Thị Thảo – K64CNSHE

Biên tập: Cao Thị Thu Thuý – K63CNSHE

Tài liệu tham khảo: 

Thi Nguyen N, Hirata M, Tanihara F, et al. Hypothermic storage of porcine zygotes in serum supplemented with chlorogenic acid. Reprod Dom Anim. 2019;54:750–755. https://doi.org/10.1111/rda.13417