Theo: Nguyen NT, Tokushima University, Tokushima, Japan, Hirata M , Tanihara F , Sato Y , Namula Z , Le QA , Wittayarat M , Fahrudin M , Otti T . In vitro Development of Zona Pellucida-free Porcine Zygotes Cultured Individually after Vitrification. Cryo Letters. 2020 Mar-Apr;41(2):86-91. PMID: 33988658.
Người dịch: Nguyễn Vũ Phương Thảo-K66CNSHA
Nguyễn Đức Hoàng-K65CNSHE
Biên tập: Cao Thị Thu Thúy - K63CNSHE
1. Giới thiệu
Hiện nay nhu cầu về phương thức bảo quản lạnh đáng tin cho việc chuyển phôi lợn biến đổi gen hay nhân bản trong giai đoạn hợp tử hoặc phân tách sớm ngày càng cao. Thủy tinh hóa (Vitrification) là một giải pháp thay thế cho trữ lạnh truyền thống, thường được áp dụng để làm đông lạnh các tế bào trứng và phôi. Nhiều kĩ thuật chuyên môn cho phương pháp này bao gồm cọng rạ đặc biệt (Open pulled straw – OPS), thủy tinh hóa bề mặt rắn (solid-surface vitrification), Crylock và Cryotop, đang được phát triển. Trong đó phương pháp Cryotop đã được áp dụng thành công cho phôi lợn tại giai đoạn hợp tử và cho hệ quả sống sót được công nhận.
Zona pellucida (ZP) là màng bao bên ngoài lớp vỏ tế bào trứng của động vật có vú. Màng đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ cơ học tế bào trứng, bám dính tinh trùng, phản ứng acrosome, duy trì mô hình phân cắt bình thường và ngăn cản sự hợp nhất phôi trong quá trình phát triển trong ống nghiệm. Việc loại bỏ ZP có thể làm mất các chức năng này và thay đổi con đường sinh lý trên sự phát triển của phôi non. Tuy nhiên, tế bào trứng không có ZP có thể tạo cơ hội dẫn đến chuyển giao nhân tế bào soma (SCNT), đặc biệt là trong quá trình nhân bản thủ công, một kĩ thuật nhân bản không ZP mà không sử dụng hệ thống vi thao tác.
Do việc thiếu ZP có thể thay đổi lớp bảo vệ cơ học của phôi trong quá trình thủy tinh hóa, nghiên cứu này hướng đến kiểm tra liệu việc loại bỏ ZP có ảnh hưởng đến sự phát triển của phôi giã đông ở giai đoạn tế bào. Nghiên cứu cũng nhằm làm sáng tỏ các chức năng của ZP trong thủy tinh hóa hợp tử và xác định thể tích môi trường thích hợp cho việc nuôi cấy từng cá thể, hợp tử nguyên vẹn ZP và hợp tử không có ZP.
2. Vật liệu và phương pháp
Thiết kế thí nghiệm
Trong thí nghiệm thứ nhất, nhóm tác giả xác định thể tích môi trường thích hợp cho việc nuôi cấy riêng lẻ phôi nguyên vẹn ZP và không có ZP.
Sau khi thụ tinh, hợp tử nguyên vẹn ZP và không có ZP được phân bổ ngẫu nhiên thành bốn nhóm và được nuôi cấy riêng lẻ trong với các thể tích PZM - 5 (Pig zygote medium) khác nhau (5,10,15 và 20 µL mỗi phôi). Những phôi đã phân cắt được chuyển thành các giọt có thể tích bằng với PBM (porcine blastocyst medium) trong ngày nuôi cấy thứ 3 sau thụ tinh. Phôi sau đó được nuôi cấy thêm 4 ngày như đã mô tả ở trên.
Trong thí nghiệm thứ hai, nhóm tác giả đã đánh giá hiệu quả bảo vệ của ZP trong quá trình bảo quản lạnh đối với kết quả phát triển của các hợp tử được thủy tinh hóa rồi giã đông, sử dụng thể tích môi trường nuôi cấy 15 µL mà họ thấy là phù hợp nhất cho sự phát triển của phôi trong thí nghiệm đầu tiên.
Các hợp tử không ZP và không có ZP được lấy mẫu cách 10 giờ sau thu tinh, sau đó được thủy tinh hóa và giã đông như mô tả ở trên. Sau khi làm ấm, phôi được nuôi cấy riêng lẻ bằng vi giọt (in micro-drops) với 15 µL môi trường nuôi cấy trong 7 ngày.
3. Kết quả
Thí nghiệm 1.
Không tìm thấy mỗi liên hệ đáng kể nào giữa thể tích môi trường nuôi cấy và sự có mặt của ZP, thể hiện bởi tốc độ phân cắt và hình thành phôi nang cũng như tổng số tế bào của phôi nang (Bảng 1). Không có sự khác biệt giữa hợp tử không ZP và hợp tử nguyên vẹn về tỷ lệ hình thành phôi nang tại các mức thể tích trung bình ở các hợp tử.
Thí nghiệm 2.
Tỷ lệ phân cắt, hình thành phôi nang và tổng số tế bào của phôi nang cho thấy không có mối tương quan đáng kể nào giữa quá trình thủy tinh hóa và lưu giữ hoặc loại bỏ ZP (Bảng 2). Không có sự khác biệt về tỷ lệ hình thành phôi nang trên phôi được thủy tinh hóa rồi rã đông của hợp tử có ZP và không có ZP. Hơn thế nữa, tỷ lệ hình thành phôi nang của hợp tử được thủy tinh hóa rồi rã đông tương tự như tỷ lệ hợp tử tươi ở mỗi loại phôi. Phương pháp thủy tinh hóa và sự tồn tại của ZP không có ảnh hưởng rõ ràng đến tổng số tế bào của phôi nang thu được.